تاریخچه و اصول کروماتوگرافی Chromatography
کروماتوگرافی (Chromatography) ترکیبی از دو کلمه (Chroma) به معنی رنگ و (Graph) به معنی نمودار یا نوشتن می باشد. بنابراین معنی لغوی کروماتوگرافی رنگ نگاری است. کروماتوگرافی برای اولین بار در سال ۱۹۰۰ توسط گیاه شناس ایتالیایی میخائیل تسوت روسی برای جداسازی رنگدانه‌های گیاهی مثل کلروفیل، کاروتن و زانتوفیل‌ها به کار گرفته شد از آنجا که این ترکیبات دارای رنگ‌های مختلف (سبز، نارنجی و زرد) هستند، اسم این روش به کروماتوگرافی معروف شد. البته امروزه از کروماتوگرافی برای شناسایی ترکیبات بیرنگ هم استفاده میشود. اصل حاکم بر انواع متفاوت روشهاي کروماتوگرافی وجود دو بخش یکی فاز ساکن و دیگري فاز متحـرك اسـت. به این ترتیب که، نمونه بر روی یک سیستم (ستون یا صفحه) که فاز ساکن نامیده میشود قرار داده میشود و توسط یک سیال (گاز یا مایع) که فاز متحرک نامیده میشود از روی فاز ساکن عبور داده میشود و به اجزای سازنده اش تفکیک میشود.
كروماتوگرافي لایه نازك TLC
کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography) که به TLC معروف است نوعی کروماتوگرافی جذبی جامد – مایع است. در این نوع کروماتوگرافی جسم جاذب جامد را به صورت یک لایه نازک در روی یک قطعه شیشه، آلومینیوم یا پلاستیک محکم پخش میکنند. یک قطره از محلول نمونه یا مجهول را در نزدیکی لبه صفحه میگذارند و صفحه را همراه مقدار کافی از حلال استخراج کننده در ظرفی قرار میدهند. مقدار حلال باید آنقدر باشد که فقط به سطح زیر لکه برسد. حلال به طرف بالای صفحه میرود و اجزاء مخلوط را با سرعتهای متفاوت با خود میبرد. در نتیجه ممکن است تعدادی لکه روی صفحه ظاهر شود. این لکه ها روی یک خط عمود بر سطح حلال ظرف قرار میگیرند.
ضریب بازداری
بعد از این‌که جداسازی به طور کامل انجام گرفت، هریک از ترکیبات جداسازی شده به صورت نقطه‌هایی ظاهر می‌شوند. هر نقطه شامل یک Rf «ضریب بازداری یا Retention factor» خواهد بود. اين عدد براي هر نمونه اي خاص همان نمونه است. بر اين اساس مي توان شناسايي كيفي مناسبي انجام داد.
عوامل تاثیر گذار بر روی Rf
عوامل تاثیر گذار شامل: ضخامت لایه- مرطوب بودن صفحه TLC- دما- عمق فاز متحرک- جنس صفحه TLC- مقدار نمونه- نوع حلال میباشند.
مشکلات معمول در کروماتوگرافی لایه نازک:
لکه های بزرگ، تشكيل رگه، جبهه فاز متحرک به صورت غیریکنواخت باشد، لكه دار شدن و قرار گرفتن نمونه بالاي سطح حلال مي باشد.
لکه های بزرگ :
لکه‌هایی که بر روی صفحه قرار می‌دهید نباید قطری بیشتر از ۱-۲ میلی‌متر داشته باشند. در نتیجه، اجزای جدا شده نمونه نیز هرگز قطری بزرگتر از نمونه اصلی نخواهند داشت. اگر لکه‌ای بسیار بزرگ داشتید ممکن است به دلیل هم‌پوشانی سایر اجزا با Rf مشابه پدید آمده باشد.
رگه
اگر نمونه‌ای که بر روی لایه (صفحه) قرار می‌گیرد، غلظت بالایی داشته باشد، نمونه به جای این‌که به شکل یک نقطه به بالا حرکت کند، به شکل «رگه‌مانند»Streak حرکت خواهند کرد. به عبارت دیگر، حلال نمی‌تواند نمونه غلیظ را به شکل مناسبی حمل کند و در حد توان خود، نمونه را به بالا میبرد و باقیمانده آن در محل اولیه بدون حرکت خواهد بود. برای جلوگیری از این اتفاق باید نمونه را رقیق کرد.
جبهه غیریکنواخت حلال
این‌که جبهه فاز متحرک به صورت غیریکنواخت باشد، از جمله مشکلات معمولی است که در کروماتوگرافی لایه نازک رخ می‌دهد و سبب میشود تا ضریب بازداری به طور صحیح محاسبه نشود. برخی از عوامل ایجاد کننده این اتفاق در زیر آورده شده‌اند.
صاف نبودن انتهای صفحه: اگر صفحه را به درستی برش نزده باشید تا به صورت کج در انتهای ظرف قرار داده باشید، جبهه‌ای غیریکنواخت خواهید داشت. برای برش مناسب بهتر است از یک خط‌کش کمک بگیرید.
کافی نبودن حلال
بسته به اندازه ظرف باید به اندازه کافی حلال داشته باشید تا به مقدار کافی به بالای ظرف منتقل شود.
بسیار کم پیش می‌آید که از آب به عنوان حلال در کروماتوگرافی لایه نازک استفاده شود چراکه به دلیل کشش سطحی، جبهه‌ای غیریکنواخت بدست می‌دهد.
لکه دار شدن
- نمونه باید بالاتر از سطح حلال قرار بگیرد و اگر این اتفاق صورت نگیرد، نمونه پیش از آن‌که در صفحه کروماتوگرافی لایه نازک به بالا حرکت کند توسط حلال، شسته خواهد شد.
- هیچ‌گاه سطح رویی صفحهTLC را با انگشتان خود لمس نکنید زیرا چربی روی پوست یا آلودگی‌های روی دستکش سبب انحراف در نتایج می‌شوند. به جای این کار، آن‌ها را از لبه‌ها بگیرید یا به کمک انبرک آزمایشگاه، آن‌ها را جابجا کنید.
جدول خلاصه نکات عملی در استفاده عملی از روش آنالیز TLC در شناسایی مواد مخدر در نمونه ادرار
نام مرحله | نکته قابل توجه |
شروع | به منظور صرفه جويي در زمان ابتدا تانك استخراج آماده شود. زيرا تانك حداقل 30 دقيقه زمان مي برد تا اشباع شود.
|
آماده سازي اوليه تانك TLC | تانک کاملا تمیز باشد و پس از ریختن فاز متحرک درب آن کاملا بسته (Seal) بماند.
|
استخراج | پس از تبخیر حلال استخراج حتما دقت شود 6 قطره نمونه ته بشر بماند و تمام نمونه كاملا خشك نشود. |
دماي هات پليت از 70 درجه بالاتر نرود زيرا سبب تجزيه شدن مواد مي شود.
| |
براي تبخير حلال مي توان از سشوار هم استفاده كرد. براي استفاده از سشوار خيلي بايد دقت شود كه بشر به خوبي در مكاني ثابت شود (داخل جعبه کوچک) و حلال كاملا تبخير نشود. | |
آماده سازی پلیت TLC | خط کشی برای لکه گذاری: حتما از مداد معمولي استفاده شود تا صفحه TLC خراشيده نشود. |
فعال سازی پلیت: دماي هات پليت از 70 درجه بالاتر نرود زيرا سبب خميده شدن صفحه TLC شده و در نتايج تاثير ميگذارد. | |
لکه گذاری پلیت TLC | هنگام افزودن متانول به بشر انگشتی حاوی نمونه لوله مویین داخل بشر نباشد. |
لكه گذاري روي هات پليت انجام شود. | |
حدودا 12 پاف از نمونه لكه گذاري شود. به اين ترتيب كه ابتدا توسط لوله مويين يك لكه گذاشته چند ثانيه صبر كرده تا خشك شود سپس دوباره لكه ديگر را قرار داده شود. تمامی محتویات بشر را با حوصله لکه گذاری کنید | |
بسته به اينكه محلول استاندارد از چه شركتي تهيه شده است به ميزان مشخص شده لكه گذاري شود. اگر از استاندارد شركت بهار زيست تهيه شده به ميزان 3 پاف استاندار ماده مخدر قرار داده شود. | |
صفحهTLC لكه گذاري شده را به مدت 1 دقيقه در جاي ثابتي افقي قرار داده تا كاملا خنك شود. | |
قرار دادن صفحات TLC در داخل تانك | از قرار دادن پلیت گرم داخل تانک خودداری شود.
|
جهت بدست آوردن باندهای واضح و جدایی کامل باندها درب تانک TLC را با وازلین آغشته کرده تا کاملا مسدود شود. | |
پایان | جهت بدست آوردن باندهای واضح بهتر است پس از خروج پلیت TLC از تانك به صورت افقي ( نه عمودي) در جايي ساكن قرار داده شود تا تبخير حلال به خوبي انجام شود. |
